外源基因在甲醇酵母Pichia pastoris中的表达策略

甲醇酵母Pichia pastoris表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，在其乙醇氧化酶基因启动子的控制下，某些外源基因的表达量可达克／升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统，但有许多因素影响外源基因在其中的表达，包括外源基因的拷贝数及其整合到酵母染色体的位置和方式、mRNA的5′和3′端非翻译区、转录起始密码子的上下文、外源基因A＋T的组成与转录和翻译的阻断、密码子的偏爱性、信号肽序列的特性、产物的稳定性、宿主菌的生理特性、培养基成份和培养条件等。在应用该表达系统过程中，这些因素均需予以考虑。本文就这些因素作了概述和讨论，有利于提高外源基因在该系统中的表达水平。     

毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

林麝白介素-2在毕赤酵母中的表达

克隆林麝（Moschus．berezovskii）白介素-2（interleukin．2，IL-2）到酵母表达载体pPIC9K，SalⅠ酶切后转化毕赤酵母GS115，G418抗性筛选高拷贝克隆，再由酵母菌落PCR鉴定；阳性克隆用甲醇诱导表达，SDS-PAGE分析．结果在诱导至第6d的酵母上清浓缩液中，检测到与预测林麝IL-2分子量相接近的，分子量约为18Ku的诱导表达带；TRIzol提取表达期间的酵母总RNA，并通过RT-PCR扩增IL-2 mRNA，发现表达期的重组酵母细胞中存在IL-2 mRNA，而对照没有检出，表明林麝IL-2存在低水平的表达。     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。     

工程菌产植酸酶摇瓶发酵条件初探

本实验根据毕赤酵母工程菌的特点,在摇瓶中对重组毕赤酵母工程菌株PP-MS-NPm-4-16的发酵条件进行初步研究。确定了60%麦芽-麸皮培养基,40%的蚕蛹培养和190mg/L的酵母营养盐作为高密度发酵的基础培养基,生长阶段和诱导阶段最佳pH分别为5.0和5.5。通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养条件为:接种量4%,甲醇浓度40g/L,生长阶段豆油浓度1.3%,诱导阶段豆油浓度3.5%,植酸酶酶活最高可达到192400U/mL。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。     

猫血清白蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

【目的】 在毕赤酵母中构建猫血清白蛋白（feline serum albumin,FSA）表达系统,并探索其最适的基本表达条件,为FSA的生产提供一种新方法。【方法】 在GenBank上获取FSA碱基序列,进行密码子优化并合成,将优化的密码子构建到载体pPIC9K上,经PCR和双酶切验证后通过电击转化将重组质粒FSA-pPIC9K转化毕赤酵母GS115,依次经MD平板和G418筛选后进行菌落PCR获得阳性菌株,随机选取阳性菌株经甲醇诱导表达96 h后,取表达上清液进行Western blotting验证。选取表达量较高的菌株分别在不同温度（24、26、28和30 ℃）、pH （4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）和甲醇诱导量（其中1组为每24 h添加0.5%,其余4组为每12 h分别添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的条件下诱导表达96 h,取表达上清液进行Western blotting验证。【结果】 菌落PCR结果显示,获得2条大小分别约为2.3和2.2 kb的目的基因条带和毕赤酵母AOX1基因扩增条带,诱导表达96 h后取表达上清液进行Western blotting验证,在70 ku左右出现特异性条带。通过基本条件优化发现该蛋白在28 ℃,pH为6.0且每12 h添加0.5%的甲醇条件下表达量较高。【结论】 毕赤酵母GS115可稳定表达FSA。     

细菌素Bacteriocin E50-52(H)基因设计 及其毕赤酵母表达载体构建

设计及合成细菌素Bacteriocin E50-52(H)基因,克隆到组成型分泌表达质粒pGAPZαA中构建重组质粒pGAPZα-Bacteriocin E(H),经PCR、测序验证正确后,电转化整合到毕赤酵母基因组,基因组PCR、测序验证结果表明成功构建了细菌素组成型重组表达载体,为在毕赤酵母中表达奠定了基础。     

一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测

利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。     

东北虎γ-干扰素基因的克隆、生物信息学分析及其在毕赤酵母中的表达

本试验旨在通过克隆东北虎γ-干扰素（IFN-γ）基因,研究其分子特征并预测蛋白生物学功能,为后续研究干扰素抗病毒活性做前期准备。通过RT-PCR从ConA诱导过的东北虎血淋巴细胞中扩增东北虎IFN-γ基因并测序,应用生物信息学方法进行序列分析。结果表明：东北虎IFN-γ编码区由504个核苷酸组成,共编码167个氨基酸,蛋白相对分子质量为19.59 ku,等电点为9.03,所编码的蛋白为碱性亲水性蛋白,其中前23个氨基酸可能为信号肽,IFN-γ编码蛋白保守结构域为IFN-γ超家族,且存在跨膜结构,其中1－6位氨基酸为胞内区域,7－28位氨基酸为跨膜区域,29－167位氨基酸为胞外区域;IFN-γ编码蛋白二级结构主要以α-螺旋（58.08%）和无规则卷曲（33.53%）为主,存在5个潜在的B细胞抗原表位,3个潜在的N-糖基化位点;分子进化分析显示,东北虎IFN-γ与GenBank上发表的东北虎、非洲狮、金钱豹、美洲狮、猎豹、家猫、加拿大猞猁、野猪等的核苷酸相似性为80.4%~99.8%,氨基酸相似性为70.5%~100%,东北虎IFN-γ与非洲狮、金钱豹亲缘关系最近,美洲狮、猎豹、家猫、猞猁次之,野猪最远。通过合成改造后的东北虎IFN-γ基因,构建能表达IFN-γ蛋白的重组质粒pPIC9K-IFN-γ,将其导入高效表达系统-毕赤酵母中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达蛋白的分子量约17.8 ku,与预期大小相符,表明东北虎IFN-γ成功表达。